MADRID 25 Nov. (EUROPA PRESS) -
Basándose en el sistema de edición de genes CRISPR, los investigadores del Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT), en Estados Unidos, han diseñado una nueva herramienta que puede cortar los genes defectuosos y sustituirlos por otros nuevos, de una manera más segura y eficiente, según publican en la revista 'Nature Biotechnology'.
Con este sistema, los investigadores demostraron que podían introducir genes de hasta 36.000 pares de bases de ADN en varios tipos de células humanas, así como en células hepáticas de ratones. La nueva técnica, conocida como PASTE, podría ser prometedora para tratar enfermedades causadas por genes defectuosos con un gran número de mutaciones, como la fibrosis quística.
"Se trata de una nueva forma genética de atacar estas enfermedades tan difíciles de tratar --explica Omar Abudayyeh, investigador del Instituto McGovern de Investigación Cerebral del MIT--. Queríamos trabajar hacia lo que se suponía que debía hacer la terapia génica en su inicio, que es sustituir genes, no sólo corregir mutaciones individuales".
La nueva herramienta combina la orientación precisa de CRISPR-Cas9, un conjunto de moléculas derivadas originalmente de los sistemas de defensa bacterianos, con enzimas llamadas integrasas, que los virus utilizan para insertar su propio material genético en el genoma bacteriano.
"Al igual que CRISPR, estas integrasas provienen de la continua batalla entre las bacterias y los virus que las infectan --apunta Jonathan Gootenberg, también becario en el Instituto McGovern--. Esto habla de cómo podemos seguir encontrando una abundancia de nuevas herramientas interesantes y útiles a partir de estos sistemas naturales".
El sistema de edición de genes CRISPR-Cas9 consiste en una enzima de corte de ADN llamada Cas9 y una cadena corta de ARN que guía a la enzima a un área específica del genoma, dirigiendo a Cas9 donde hacer su corte. Cuando Cas9 y el ARN guía dirigido a un gen enfermo se introducen en las células, se realiza un corte específico en el genoma y los procesos de reparación del ADN de las células pegan el corte, eliminando a menudo una pequeña porción del genoma.
Si también se suministra una plantilla de ADN, las células pueden incorporar una copia corregida en sus genomas durante el proceso de reparación. Sin embargo, este proceso requiere que las células realicen roturas de doble cadena en su ADN, lo que puede causar deleciones o reordenamientos cromosómicos perjudiciales para las células. Otra limitación es que sólo funciona en las células que se dividen, ya que las que no se dividen no tienen procesos de reparación del ADN activos.
El equipo del MIT quería desarrollar una herramienta que pudiera eliminar un gen defectuoso y sustituirlo por uno nuevo sin inducir ninguna rotura de doble cadena de ADN. Para lograr este objetivo, recurrieron a una familia de enzimas llamadas integrasas, que los virus llamados bacteriófagos utilizan para insertarse en los genomas bacterianos.
Para este estudio, los investigadores se centraron en las integrasas de serina, que pueden insertar trozos enormes de ADN, de hasta 50.000 pares de bases. Estas enzimas se dirigen a secuencias específicas del genoma conocidas como sitios de fijación, que funcionan como "plataformas de aterrizaje". Cuando encuentran la plataforma correcta en el genoma del huésped, se unen a ella e integran su carga de ADN.
En trabajos anteriores, los científicos han encontrado difícil desarrollar estas enzimas para la terapia humana porque las plataformas de aterrizaje son muy específicas, y es difícil reprogramar las integrasas para que se dirijan a otros sitios. El equipo del MIT se dio cuenta de que la combinación de estas enzimas con un sistema CRISPR-Cas9 que inserta el lugar de aterrizaje correcto permitiría reprogramar fácilmente el potente sistema de inserción.
La nueva herramienta, PASTE (Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements), incluye una enzima Cas9 que corta en un sitio genómico específico, guiada por una cadena de ARN que se une a ese sitio. Esto les permite dirigirse a cualquier sitio del genoma para insertar el sitio de aterrizaje, que contiene 46 pares de bases de ADN. Esta inserción puede realizarse sin introducir ninguna rotura de doble cadena, añadiendo primero una hebra de ADN a través de una transcriptasa inversa fusionada y luego su hebra complementaria.
Una vez incorporado el punto de aterrizaje, la integrasa puede venir e insertar su carga de ADN mucho más grande en el genoma en ese sitio. "Creemos que es un gran paso hacia la consecución del sueño de la inserción programable de ADN --afirma Gootenberg--. Es una técnica que puede adaptarse fácilmente tanto al sitio que queremos integrar como a la carga".
En este estudio, los investigadores demostraron que podían utilizar el sistema PASTE para insertar genes en varios tipos de células humanas, como las hepáticas, las células T y los linfoblastos (glóbulos blancos inmaduros). Probaron el sistema de entrega con 13 genes diferentes de carga útil, incluidos algunos que podrían ser terapéuticos, y fueron capaces de insertarlos en nueve lugares diferentes del genoma.
En estas células, los investigadores pudieron insertar genes con una tasa de éxito que oscilaba entre el 5 y el 60 por ciento. Este método también produjo muy pocos "indels" (inserciones o deleciones) no deseados en los lugares de integración de los genes. "Vemos muy pocos indels, y como no hacemos roturas de doble cadena, no hay que preocuparse por reordenamientos cromosómicos o supresiones de brazos cromosómicos a gran escala", dice Abudayyeh.
Los investigadores también demostraron que podían insertar genes en hígados "humanizados" de ratones. Los hígados de estos ratones están formados por un 70 por ciento de hepatocitos humanos, y PASTE consiguió integrar nuevos genes en un 2,5 por ciento de estas células.
Las secuencias de ADN que los investigadores insertaron en este estudio tenían una longitud de hasta 36.000 pares de bases, pero creen que también podrían utilizarse secuencias aún más largas. Un gen humano puede tener desde unos cientos hasta más de 2 millones de pares de bases, aunque para fines terapéuticos sólo es necesario utilizar la secuencia codificante de la proteína, lo que reduce drásticamente el tamaño del segmento de ADN que hay que insertar en el genoma.
Los investigadores están estudiando ahora la posibilidad de utilizar esta herramienta como una posible forma de sustituir el gen defectuoso de la fibrosis quística. Esta técnica también podría ser útil para tratar enfermedades de la sangre causadas por genes defectuosos, como la hemofilia y la deficiencia de G6PD, o la enfermedad de Huntington, un trastorno neurológico causado por un gen defectuoso que tiene demasiadas repeticiones.
También han puesto sus construcciones genéticas a disposición de otros científicos en Internet. "Una de las cosas fantásticas de la ingeniería de estas tecnologías moleculares es que la gente puede basarse en ellas, desarrollarlas y aplicarlas de formas que quizá no se nos habían ocurrido o no habíamos considerado --resalta Gootenberg--. Es realmente fantástico formar parte de esa comunidad emergente".
